一、研究背景

應用于外周神經系統的生物電子器件為轉化醫學提供了廣闊前景，可治療多種疾病，包括慢性偏頭痛、中風、癲癇、抑郁癥、步態障礙、膀胱過度活動癥和高血壓等。這些通過外周神經刺激的臨床治療，常是耐藥患者化學療法之外的唯一選擇，且技術仍在不斷發展。

然而，生物電子界面與外周神經長期可靠性和整合的關鍵挑戰在于異物反應（FBR），這是生物電子器件在體內失效的主要原因。先天免疫細胞最初浸潤界面，引發炎癥反應，導致富含細胞的異物反應，包括巨噬細胞和多核巨細胞的形成。隨著時間推移，成纖維細胞活化導致植入生物電子器件與外周神經界面處沉積富含膠原蛋白的纖維囊。慢性異物反應使這些纖維囊增厚，顯著降低記錄和刺激過程中的界面電性能，最終影響生物電子器件的使用壽命。

為應對異物反應帶來的挑戰，已出現多種材料設計策略，包括超軟、親水、潤滑、藥物緩釋、兩性離子、生物分子共軛和機械驅動等特性。盡管這些努力旨在減輕纖維化，但由于異物反應的發生在很大程度上與材料無關，以往的嘗試均未能成功完全阻止纖維化的發生。因此，開發一種能有效抑制纖維化、實現長期穩定神經調節的生物電子界面具有重要的臨床意義。

二、研究內容

2.1 核心研究思路

研究提出，生物電子器件與外周神經界面之間的強粘附性可完全防止纖維囊的形成。生物粘附水凝膠通過與外周神經表面形成共價鍵，實現生物電子界面的共形接觸，從而抑制免疫細胞浸潤界面和后續纖維囊的形成。這種粘附性有助于外周神經的電刺激或記錄，同時防止界面微動引起的機械驅動型異物反應。

基于此，研究開發了一種粘附性非纖維化生物電子器件（ANB），旨在實現多樣化神經上的可靠長期植入，且界面無纖維囊形成。該器件可包裹并粘附于體內不同部位、不同尺寸的外周神經，同時具備柔軟、靈活、可拉伸、粘附性和導電性等關鍵材料特性，以適應生理環境中外周神經的長期穩定通信需求。

2.2 器件設計與制備

ANB采用生物相容性材料設計，用于基于粘附的多種外周神經植入，主要包括三層結構：

• 聚氨酯（PU）絕緣層
• 聚（3,4-乙烯二氧噻吩）-聚苯乙烯磺酸鹽（PEDOT:PSS）導電水凝膠
• 聚（乙烯醇）/聚（丙烯酸）（PVA/PAA）基生物粘附水凝膠

由于大鼠外周神經尺寸較小（直徑300至1200μm），研究采用多材料三維（3D）打印技術精確圖案化絕緣層和導電水凝膠，可在10分鐘內快速、方便且精確地制造出分辨率為100μm的生物電子器件。

圖1 粘附性非纖維化生物電子器件（ANB）作為非纖維化界面策略的設計和機制。 (A) 生物電子器件治療疾病的臨床應用示意圖； (B) 纖維囊形成對神經造成限制的示意圖，活躍的異物反應（FBR）導致嚴重纖維化并阻礙電傳遞，導致生物電子器件失效； (C) ANB利用生物粘附水凝膠建立非纖維化界面的機制，實現完整的電刺激； (D) 具有非纖維化界面的ANB圖像，ANB以牢固且緊密的方式植入腓總神經（CPN）中分離出的腓深神經（DPN）和腓淺神經（SPN），ANB的生物粘附水凝膠與坐骨神經（SN）形成共形接觸并防止纖維囊形成； (E) ANB制備和植入的示意圖：(1) 通過3D打印圖案化絕緣層和導電水凝膠；(2) 在生物電子器件上整合非纖維化粘附水凝膠并完全干燥；(3) 將ANB包裹在DPN周圍并在界面處按壓5秒以形成酰胺鍵和氫鍵； (F) ANB與生物組織接觸的界面韌性結果，每個實驗獨立重復（n=3），統計顯著性和P值通過雙側非配對t檢驗確定（NS表示無顯著性差異）。

生物粘附水凝膠膜通過先前建立的方案單獨制備，預拉伸以匹配其溶脹率，并在交聯后立即附著到3D打印的生物電子器件上，然后干燥。與外周神經接觸時，干燥的生物粘附層吸收界面水分，形成氫鍵（物理交聯）和酰胺鍵（共價交聯）。這種基于N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）-胺共價偶聯的粘附機制已通過實驗驗證。

2.3 關鍵性能表征

2.3.1 機械性能

ANB表現出有利于長期植入的機械性能：

• 低楊氏模量（約0.75 MPa）
• 大最大拉伸率（>1000%）
• 高拉伸強度（約6.8 MPa）

與外周神經直接接觸的生物粘附水凝膠層的楊氏模量（約0.1 MPa）與大鼠神經外膜（約0.4±0.1 MPa）相當，確保了與宿主組織的機械相容性。在20%應變下經過10,000次拉伸循環后，器件保持完整，各層之間無分層跡象，其高順應性和可拉伸性適應了外周神經隨身體運動的自然活動，從而提高了其在體內的長期穩定性。

2.3.2 非纖維化界面驗證

為驗證ANB植入后4周粘附性生物電子界面是否保持非纖維化，研究通過蘇木精-伊紅（H&E）和馬松三色（MT）染色的組織學分析，在Sprague Dawley（SD）大鼠模型中檢查了外周神經表面的纖維囊，比較了三組樣本：(i) 無植入物的天然組織；(ii) 附著ANB 4周的粘附界面；(iii) 非粘附界面（ANB先在無菌磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中完全溶脹以去除水凝膠的粘附特性，然后縫合在神經上）。

研究考慮了大鼠全身不同尺寸（直徑300至1200μm）的外周神經，包括枕神經、迷走神經、腓深神經、坐骨神經、脛神經和腓總神經。組織學分析顯示，天然組織的神經外膜周圍表面完整，粘附界面未觀察到可見的纖維囊形成，與所有考慮的神經的天然組織組相當；而所有非粘附界面在神經外膜外側均表現出厚且富含細胞的纖維囊，包括脂肪組織壞死和隨后的疤痕組織形成。

圖2 非纖維化生物電子界面的驗證。 (A) ANB在多種外周神經上植入4周，使用了枕神經、迷走神經、腓深神經、坐骨神經、脛神經和腓總神經（CPNs），比例尺為1mm； (B至D) 生物電子器件植入4周前后外周神經的代表性組織學圖像，比較三組：天然組織（B）、粘附界面（C）和非粘附界面（D），每條神經均用H&E（左）和MT（右）染色，虛線表示神經的外膜，比例尺為500μm； (E至G) 坐骨神經的放大組織學圖像，聚焦于外膜周圍的界面，比較天然組織（E）、粘附界面（F）和非粘附界面（G），虛線表示外膜的邊界，比例尺為100μm； (H) 多種外周神經外膜厚度的定量分析，箱線圖中，中心線表示平均值，須表示數據的第5和第95百分位數，每個實驗獨立重復（每組n=8），統計顯著性和P值通過雙側非配對t檢驗確定（NS表示無顯著性差異，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

2.3.3 電性能與穩定性

ANB的電性能表現優異，在1kHz時阻抗約為0.76千歐，導電率良好，電荷存儲容量（CSC）約為10.5 mC/cm2，電荷注入容量（CIC）約為290 μC/cm2。與鉑電極、純粘附劑和僅3D打印的生物電子器件（無生物粘附水凝膠）相比，盡管應用生物粘附水凝膠略微降低了整體性能，但ANB仍表現出高質量的刺激電性能，這是因為水凝膠提供了足夠的導電性，使電荷能夠從電極轉移到神經，同時陰極和陽極之間的相對較大間距防止了串擾。

在循環電測試、機械測試和室溫PBS浸泡下的分析表明，ANB具有長期穩定性：在100,000次充放電循環中，CSC增加了43%；在100,000次CIC循環中，CIC下降了18%，但仍足以在體內刺激神經；在10,000次拉伸循環（100%拉伸）和室溫PBS浸泡12周后，ANB的CSC和CIC保持穩定或有所改善。

圖3 ANB與鉑電極、純粘附劑和生物電子器件的電性能和長期穩定性比較。 (A) 不同頻率范圍內的阻抗（上）和1kHz時的相應阻抗（下）； (B) 電導率圖； (C) 電流密度作為施加電位的函數，帶有每種材料的抗腐蝕窗口，抗腐蝕窗口的細節在圖S14中解釋； (D) 根據從最大陽極電位（Ems）到最大陰極電位（Emc）的陰極雙相脈沖，電位輸入誘導的電流密度； (E) 分別從圖(C)和(D)得出的CSC（左軸）和CIC（右軸）的結果圖； (F) ANB的CSC與循環伏安法循環（上）和CIC與CIC循環（下）的關系，紅色虛線表示第一個循環的初始值，阻抗、電導率、CSC和CIC的值表示平均值和標準差（n=3；獨立樣本）； (G) 阻抗（左）、CSC（中）和CIC（右）的圖，歸一化為第一個拉伸循環的初始值，作為100%拉伸下拉伸循環的函數； (H) 阻抗（左）、CSC（中）和CIC（右）的圖，歸一化為浸泡在PBS溶液中之前的初始值，作為在PBS溶液中浸泡時間的函數，紅色虛線表示第一個拉伸循環和浸泡在PBS溶液中之前的初始值，阻抗、CSC和CIC的值表示平均值和標準差（n≥5；獨立樣本）。

2.4 體內長期血壓調控實驗

為評估生物電子器件中非纖維化界面的功效和重要性，研究使用ANB或非粘附器件刺激腓深神經（DPN）4周，通過無創尾袖法每周監測自發性高血壓大鼠的血壓（BP）和心率（HR）。選擇血壓調控作為主要功能讀數，因為它是DPN傳導的靈敏整體測量指標，即使是輕微的傳導缺陷也會削弱這種全身反應，使血壓成為比局部神經電圖記錄更具轉化相關性的指標。

研究通過改變電流脈沖的幅度（0.1至1.0 mA）、寬度（100至1000 μs）和數量（N=1至200個脈沖），確定了最佳刺激參數：0.2 mA、100 μs和N=50個脈沖。使用該參數刺激時，自發性高血壓大鼠的血壓可降至正常大鼠水平，并在刺激結束后維持40分鐘以上，且心率保持在約400次/分鐘，未出現傳統方法中常見的心率下降副作用。

長期刺激實驗表明，ANB在4周的刺激后仍能實現血壓調控，達到與正常大鼠相似的水平，各時間點血壓下降幅度穩定在33%-37%；而非粘附器件僅在植入后立即能夠調控血壓，1周后刺激效果顯著下降，4周時血壓下降幅度僅為2%。

圖4 生物電子器件的粘附界面和非粘附界面在DPN刺激下的血壓調控和心率變化比較。 (A) 在自發性高血壓大鼠（SHR）中使用ANB或非粘附器件進行DPN刺激時，BP和HR測量配置的示意圖，比例尺為1mm，W表示周； (B) 比較SHR和正常大鼠在無DPN刺激時的BP和HR圖； (C至E) SHR在DPN刺激期間的BP調控特征，三組分別為：電流脈沖幅度變化（0.1至1.0 mA；C）、脈沖寬度變化（100至1000 μs；D）和脈沖數量變化（1至200個脈沖；E），DPN刺激的標準電流脈沖使用0.2 mA的幅度、100 μs的脈沖寬度和N=1個脈沖，綠點表示使用不同電流脈沖的刺激時間，圖中顯示連續BP（上）和HR（下）； (F) 根據不同電流脈沖的DPN刺激，相應BP（紅條；左軸）和HR（藍條；右軸）的圖，以表征BP調控； (G) 4周內長期DPN刺激期間測量的連續BP圖，電流脈沖（0.2 mA、100 μs和N=50個脈沖）以0.2 Hz的間隔施加10分鐘，由具有粘附界面的ANB（紅線；上）和具有非粘附界面的縫合器件（藍線；下）施加，綠色虛線表示正常大鼠的BP范圍（76至85 mmHg），(B)、(F)和(G)中的值表示平均值和標準差，每個實驗獨立重復（n=3）。

2.5 神經刺激后的免疫熒光分析

為進一步驗證粘附性生物電子界面的長期抗纖維化性能，研究對每周刺激一次、植入12周后收集的DPN樣本進行了免疫熒光分析，比較了天然組織、ANB和非粘附器件三組樣本。結果顯示：

• 非粘附界面的神經絲密度比天然組織降低了28%，神經束收縮，表明功能喪失和持續炎癥；
• 非粘附植入物的神經內觀察到顯著的巨噬細胞（CD68）浸潤，比天然組織增加了45%；
• 非粘附器件周圍的血管生成更強，整個神經外膜和纖維囊的血管密度比天然組織高56%（α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA））；
• 非粘附界面的神經外膜和纖維囊中有大量I型膠原蛋白（Col-I）沉積，導致外膜顯著增厚，達到粘附界面厚度的三倍以上；
• 植入ANB的DPN表現出與天然組織相當的神經絲密度，在所有評估指標上都與天然組織非常相似，未觀察到神經和粘附界面中的巨噬細胞浸潤，神經周圍沒有可檢測到的成纖維細胞活性或纖維化膠原蛋白沉積。

圖5 DPN神經刺激后的免疫熒光圖像。 (A至C) 比較天然組織（A）、ANB植入12周后的粘附界面（B）和非粘附器件植入12周后的非粘附界面（C）中的神經絲（NF；綠色）、巨噬細胞（CD68；紅色）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA；紅色）、I型膠原蛋白（Col-I；紅色）和細胞核[4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）；藍色]，NF、CD68、α-SMA、Col-I和DAPI分別代表神經束、巨噬細胞、血管、膠原蛋白和細胞核的標志物，虛線和箭頭表示天然組織和非粘附界面的外膜區域以及粘附界面的外膜-ANB區域，在非粘附界面觀察到纖維囊，比例尺為200μm； (D至F) 免疫熒光結果的定量分析，比較天然組織（黑色）、粘附界面（紅色）和非粘附界面（藍色）中每1000μm2的NF數量（D）、巨噬細胞數量（E）、血管數量（G）和膠原蛋白總面積（F），每個實驗獨立重復（每組n≥3），統計顯著性和P值通過雙側非配對t檢驗確定（NS表示無顯著性差異，*P<0.05，**P<0.01）。

三、研究結論

1. 研究開發的粘附性非纖維化生物電子器件（ANB）通過生物粘附水凝膠與外周神經形成強共價鍵連接，成功抑制了免疫細胞浸潤和纖維囊形成，在多種外周神經（枕神經、迷走神經、腓深神經、坐骨神經、脛神經和腓總神經）上實現了長達12周的非纖維化界面穩定存在。
2. ANB具有優異的機械性能（低模量、高拉伸性、良好的機械相容性）和電性能（低阻抗、高電荷存儲和注入容量），且在長期體內環境中保持穩定，經過10,000次拉伸循環和12周浸泡后仍能維持良好的性能。
3. 在自發性高血壓大鼠模型中，ANB通過對腓深神經的長期穩定刺激（長達4周），實現了有效的血壓調控，血壓下降幅度穩定在33%-37%，且未出現傳統方法中常見的心率下降副作用；而非粘附器件的刺激性能在1周后顯著下降，4周時幾乎完全失效。
4. 免疫熒光分析證實，ANB界面在12周后仍保持與天然神經組織相似的神經絲密度，無明顯巨噬細胞浸潤、血管異常增生和成纖維細胞活化，而非粘附界面則出現明顯的纖維化特征。
5. 該研究提出的基于粘附的策略為解決生物電子器件與外周神經界面的纖維化問題提供了新的有效途徑，ANB器件展現出巨大的臨床轉化潛力，可用于長期、非纖維化的器件整合，為基于生物電子學的疾病治療、康復和人體增強開辟了新的方向。

四、論文信息