大面積顱骨缺損修復是臨床長期面臨的難題，目前常用解決方案包括自體血管化骨移植、聚醚醚酮（PEEK）顱骨植入物及鈦/鈦合金網，但這些方法存在顯著局限性：
研究團隊前期開發的聚己內酯靜電紡納米纖維支架（3D定向拓撲結構）雖實現高效細胞募集與快速骨再生，但3D打印支架普遍存在細胞接種效率低、無法誘導細胞遷移的問題。因此，亟需開發兼具高效細胞募集、血管化促進及骨分化調控能力的新型骨修復支架，以解決大面積顱骨缺損的再生難題。
A：ACFs復合3D打印支架（PS/ACFs）的制造流程：通過3D打印結合定向冷凍鑄造技術將ACFs嵌入3D打印支架，實現細胞募集與組織趨向性（紅色箭頭示細胞募集，橙色箭頭示ACFs在顱骨缺損中的作用）；
B：KP肽（骨形態發生蛋白2模擬肽）與QK肽（血管內皮生長因子模擬肽）功能化的PS/ACFs支架促進大鼠臨界尺寸顱骨缺損修復的機制（藍色箭頭示新生膠原纖維方向，綠色箭頭示骨髓間充質干細胞（BMSCs）的成骨分化）；
注：Gel-MA為甲基丙烯酰化明膠，PS為3D打印支架，BMSC為骨髓間充質干細胞。
研究提出“結構引導-功能調控”雙策略，設計并制備含垂直定向冷凍凝膠纖維（ACFs）且經QK肽（促血管）與KP肽（促成骨）修飾的復合3D打印支架（PS-KP500/ACFs-QK500），制造流程如下：
A：通過3D打印結合冷凍鑄造制備ACFs復合3D打印支架的流程示意圖（UV為紫外光）；
B：PS與PS/ACFs凍干前后的宏觀外觀（凍干后PS/ACFs孔洞內填充白色纖維）；
C：PS與PS/ACFs的掃描電鏡（SEM）圖（俯視圖與橫截面），可見PS/ACFs孔洞內充滿垂直定向纖維，PS無纖維填充；
D：ACFs的偽彩色圖（示纖維取向角度分布）；
E：ACFs的取向角度分布（中位角度近90°，呈高度垂直定向）；
F：ACFs的直徑分布（1-5μm，均值2.46±0.86μm）；
注：Oct為最佳切割溫度化合物。
（1）理化性能：
（2）細胞募集能力：
A：（i）PS、PS/RCFs、PS/ACFs的體外細胞接種與黏附示意圖；（ii）大鼠皮下植入模型評估PS/ACFs的體內細胞募集與組織長入示意圖；
B-C：共聚焦顯微鏡3D圖像與SEM圖（人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）接種24小時后）：PS僅表面黏附細胞（深度＜200μm），PS/RCFs細胞遷移至300μm深度，PS/ACFs細胞遷移至600μm深度，且細胞優先附著于纖維區域；
D：CCK-8檢測（24小時）：PS/ACFs與PS/RCFs的細胞黏附量為PS的2倍；
E-G：蘇木精-伊紅（H&E）染色與半定量分析（皮下植入1、2周）：PS/ACFs的Gel-MA晶格間隙內浸潤細胞更多，ACFs區域新生組織密度顯著高于PS的空白區域，且無纖維囊形成；
H-I：三色染色（2周）：PS組新生細胞外基質（ECM）纖維隨機排列，PS/ACFs組呈有序排列（與ACFs方向一致），偽彩色圖與角度定量驗證PS/ACFs組膠原纖維取向一致性更高；
注：*P<0.001，****P<0.0001，ns為無顯著性差異。
關鍵結論：ACFs通過定向拓撲結構引導細胞深度遷移（達600μm），顯著提升細胞接種效率與體內組織長入，且誘導新生ECM纖維定向排列，為骨再生提供結構基礎。
（1）KP肽修飾支架（PS-KP）的促成骨性能：
A：PS-KP的制備流程與裸鼠皮下異位成骨模型驗證示意圖（n=5）；
B：Micro-CT 3D重建圖（4周）：PS-KP500組（500μg/ml KP肽）可見明顯新生骨，PS、PS-KP250（250μg/ml）、PS-KP750（750μg/ml）組幾乎無新生骨；
C：Micro-CT軸位、矢狀位與冠狀位圖像：PS-KP500組新生骨呈與支架一致的晶格形態；
D-G：定量分析（4周）：PS-KP500組的骨體積分數（BV/TV）、骨表面積分數（BS/TS）、骨小梁數量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）顯著高于其他組；
H：三色染色（4周）：PS-KP500組類骨質基質呈團塊狀分布，其他組僅少量或無類骨質；
I-J：骨橋蛋白（OPN）免疫組化染色與半定量：PS-KP500組OPN表達最高，顯著高于PS-KP750組；
注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，IOD為積分光密度。
體外實驗顯示：PS-KP各組的大鼠BMSC（rBMSC）堿性磷酸酶（ALP）活性、ALP/OPN/骨鈣素（OCN）基因表達均高于純PS；體內異位成骨實驗證實500μg/ml為KP肽最佳濃度，可顯著促進類骨質形成與骨標志物表達。
（2）QK肽修飾支架（PS/ACFs-QK）的促血管性能：
A：PS/ACFs-QK的制備流程與大鼠皮下植入模型評估示意圖（n=4）；
B：三色染色（2周）：新生血管數量隨QK肽濃度（100-500μg/ml）增加而增多；
C：新生血管數量定量：PS/ACFs-QK500組（500μg/ml）顯著高于其他組；
D-E：CD31免疫組化染色與血管面積定量：PS/ACFs-QK300（300μg/ml）與QK500組新生血管面積高于PS與QK100組，且QK500組高于QK300組；
注：*P<0.05，***P<0.001，ns為無顯著性差異。
結果表明：500μg/ml為QK肽最佳濃度，可通過模擬血管內皮生長因子（VEGF）功能，顯著促進皮下植入區域的新生血管形成，為骨再生提供充足營養。
A：實驗支架（PS-KP500/ACFs-QK500）與膠原海綿（陽性對照）植入大鼠8mm直徑臨界尺寸顱骨缺損的示意圖（n=5）；
B：X線原始圖像（4、8周）：PS-KP500/ACFs-QK500與膠原海綿組的缺損區域新生骨多于對照組；
C-D：Micro-CT 3D重建圖與冠狀位圖像（4、8周）：PS-KP500/ACFs-QK500組8周時新生骨體積與分布更優；
E-F：定量分析（4、8周）：4周時兩組骨體積分數（BV/TV）與表面覆蓋率無顯著差異；8周時PS-KP500/ACFs-QK500組顯著高于膠原海綿組；
注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns為無顯著性差異。
A-B：H&E與三色染色（n=5）：PS-KP500/ACFs-QK500與膠原海綿組缺損區域可見更多新生骨（NB）有機基質，對照組極少；PS-KP500/ACFs-QK500組檢測到垂直定向膠原纖維（由ACFs引導），且纖維內形成脫鈣有機骨基質；
C-F：缺損邊緣與中心區域新生軟組織的三色染色與角度分布：對照組與膠原海綿組膠原組織水平排列，PS-KP500/ACFs-QK500組呈垂直排列；
注：NB為新生骨，C為膠原海綿，PS為3D打印支架。
A-B：H&E與三色染色（n=5）：8周時PS-KP500/ACFs-QK500組缺損區域新生有機骨基質最多，且支架區域（PS）被新生骨包裹；
C：免疫組化染色（CD31、OCN、OPN、RUNX2）：PS-KP500/ACFs-QK500組的血管標志物（CD31）與成骨標志物（OCN、OPN、RUNX2）表達最高；
D-G：積分光密度定量：PS-KP500/ACFs-QK500組的CD31、OCN、OPN、RUNX2相對表達量顯著高于膠原海綿與對照組；
注：*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001，RUNX2為 Runt相關轉錄因子2（成骨關鍵轉錄因子）。
關鍵發現：
| 類別 | 關鍵參數/步驟 |
|---|---|
| 核心材料 | 甲基丙烯酰化明膠（Gel-MA）、KP肽（BMP-2模擬肽）、QK肽（VEGF模擬肽）、膠原海綿（陽性對照） |
| 支架制備 | 3D打印參數：25號針頭，層高0.2mm，線距1.2mm，打印速度6mm/s；定向冷凍溫度-80℃，交聯24小時 |
| 性能表征 | SEM（形貌）、Micro-CT（骨再生定量）、電子萬能試驗機（機械性能）、CCK-8（細胞活性） |
| 動物模型 | 大鼠皮下植入模型、裸鼠異位成骨模型、大鼠8mm臨界尺寸顱骨缺損模型 |
| 組織學分析 | H&E染色、三色染色、免疫組化（CD31/OCN/OPN/RUNX2）、TRAP染色（破骨細胞檢測） |
全面解析森工DIW墨水直寫3D打印機在該類研究中功能匹配情況及需定制功能，幫助用戶更好地選擇合適的3D打印設備及功能模塊。
①紫外固化輔助成型：該模塊輔助配備365nm/385m/395m/405m多種波長范圍，有效輔助含光引發劑直寫材料的輔助固化成型；
②墨水擠出打印：適合低粘度生物材料，如水凝膠、明膠等；
①可搭載低溫直寫噴頭/平臺模塊該模塊支持-5℃-室溫，能快速提高固化效率，保障材料打印成型效果；
②可升級多通道打印頭，實現協同打印不同材料和細胞液滴入進行培養；
③搭載轉軸模塊為不同直徑、不同長度類型的管狀支架提供更多實驗空間；
④為了提高實驗效率，可使用在線混合模塊，將生物材料與特定性能材料進行實時比混合，在多噴頭協作時間同時滿足更多不同打印方式；
①低溫直寫噴頭/平臺模塊：支持-5℃~室溫，噴頭料筒滿載容量10cc，獨立分布式控溫，打印材料在料筒及針尖均可實現精確溫控；低溫平臺實現模塊化冷井設計，支持對玻片、孔板（6、12、24、48、96孔）直接使用，有效制冷區域尺寸：90mm*90mm*75mm；控溫范圍：-5℃-室溫
②多通道打印頭： 2-4通道設計，可裝載多材料進行協同/并聯打印，如通過設備移液功能，同時進行細胞溶液滴入，提高實驗效率；
③轉軸模塊：旋轉軸直徑支持：φ1.5 φ2 φ4 φ6 φ8 φ10 φ20 φ25 旋轉軸打印長度：φ1.5 φ2 φ4 φ6 φ8 φ10 可打印長度100mm，φ20 φ25 可打印長度95mm；滿足更多不同規格直徑需求，實現多種個性化組織支架打印；
④在線混合模塊：主動混合或者被動混合模式，可實時在線混合，實現指定比例混合材料、在線梯度漸變；
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